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本制品是表达纯化获得的一种免疫球蛋白IgG降解酶。IdeZ Protease具有极高的底物特异性，仅能识别人等特定种属和特定类型的IgG，并在抗体铰链区下方的特定位点进行酶切，使IgG水解为完整的F(ab')2片段和Fc片段(参考图1)。IdeZ Protease作为工具酶主要应用于抗体类药物或抗体融合蛋白药物的结构表征分析，制备仅包含F(ab')2片段的抗体或抗体的Fc片段，也可用于免疫沉淀后Western检测时去除重链对于目标蛋白检测的干扰等用途。

IdeZ Protease可有效切割人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，还可以切割兔、大鼠、猴、绵羊(Sheep)、人源化和嵌合的IgG以及Fc融合蛋白，如Enbrel。但IdeZ Protease不能切割小鼠IgG1/IgG2b，猪、牛或山羊IgG，以及非IgG同种型免疫球蛋白，包括IgA、IgM、IgD和IgE。与IdeS Protease相比，IdeZ Protease对大鼠、小鼠IgG2a和IgG3的酶切活性显著提高。

图1．IdeZ Protease用于切割人IgG的效果示意图。IdeZ Protease酶切后，在非还原性和非变性条件下可以产生100kD的F(ab')2和50kD的Fc；如果在变性和还原性条件下会产生2个25kD的Fd'片段，2个25kD的LC片段和2个25kD的Fc/2片段。酶切过程中或非酶切过程中都可使用PNGase F对抗体进行去糖基化。

抗体类药物或抗体融合蛋白药物的结构表征分析，酶切产生制备仅包含F(ab')2片段的抗体或抗体的Fc片段，也可以用于免疫沉淀后Western检测时去除重链对于目标蛋白检测的干扰等用途。

1单位是指在37℃条件下，10μL反应体系中，15分钟内对1μg人IgG底物，完成>95%酶切所需的酶量。

组分	1kU	5kU	20kU
IdeZ Protease(干粉)	1kU	5kU	5kU×4
IdeZ稀释缓冲液	200μL	1mL	4mL
10×Reaction Buffer	200μL	1mL	4mL

保存：-20℃，有效期2年。


Lyophilized from 50mM Sodium Phosphate，150mM NaCl，pH6.6@25℃。


IdeZ稀释缓冲液：50mM Sodium Phosphate，150mM NaCl，pH6.6@25℃。
10×Reaction Buffer：500mM Sodium Phosphate，pH7.5@25℃。

• 经SDS-PAGE检测，纯度大于95%；
  
• 不含除IdeZ Protease之外的其它种类蛋白酶，不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶，不含磷酸酯酶。

65℃孵育10分钟，可使IdeZ Protease失活。

• IdeZ Protease使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。
  
• IdeZ Protease对不同物种IgG的酶切效率存在较大差异，酶切特定物种的IgG时，建议适当摸索反应孵育时间和使用酶量。IdeZ Protease对小鼠IgG2a和IgG3的切割效率偏低，建议增加IdeZ Protease的使用量(建议5倍至10倍作为起点)或延长反应孵育时间(2小时至过夜)以实现对小鼠IgG2a和IgG3的充分酶切。
  
• IdeZ Protease在中性pH或接近中性pH的缓冲体系中活性最强，且酶切体系中盐浓度不宜过高，推荐使用本制品提供的10×Reaction Buffer进行酶切反应。在使用pH6～8范围以外的缓冲液(例如醋酸盐缓冲液)时，孵育时间或酶量需要根据实际情况进行优化。

• IdeZ Protease用于切割人、兔和驴IgG的效果参考图2。
  
  图2．IdeZ Protease用于切割人、兔和驴IgG的效果图。在25μL反应体系(50mM Sodium Phosphate，pH7.5@25℃)中，加入10μg　人IgG、兔IgG、驴IgG，再加入2.5μL的10×Reaction Buffer以及图中指定量的本制品，然后用超纯水补至25μL，37℃孵育30分钟进行酶切。反应结束后，立即65℃孵育10分钟以终止反应。取出10μL反应产物，加入2μL 6×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色(使用考马斯亮蓝超快染色液)，拍照观察结果。实验结果表明，本制品对人和兔IgG具有明显的切割效果，并且对于兔IgG有非常高的酶活性，但不能特异性识别与切割驴IgG。实际使用效果会因实验条件、实验材料等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。
  
• IdeZ Protease用于切割大鼠IgG的效果参考图3。
  
  图3．IdeZ Protease用于切割大鼠IgG的效果图。在25μL反应体系(50mM Sodium Phosphate，pH7.5@25℃)中，加入10μg 大鼠IgG，再加入2.5μL的10×Reaction Buffer以及图中指定量的本制品，然后用超纯水补至25μL，37℃孵育120分钟进行酶切。反应结束后，立即65℃孵育10分钟以终止反应。取出10μL反应产物，加入2μL 6×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色(使用考马斯亮蓝超快染色液)，拍照观察结果。实验结果表明，本制品能识别并切割大鼠IgG，但酶切效率相对较低，需要增加使用酶量或延长反应时间才能达到充分切割的目的。实际使用效果会因实验条件、实验材料等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

• 首次打开管盖前，建议8000～12000×g离心约10秒，使附着在管盖或管壁上的蛋白聚集于管底。随后取IdeZ Protease(干粉)，加入适量超纯水(推荐使用无菌无酶超纯水)，配制成终浓度为10U/μL的工作液，按照20μL/管分装到1.5mL的离心管中，-20℃保存，以避免反复冻融影响酶活。
  
• 室温解冻IdeZ Protease，并参考下表在冰浴中配制反应体系(以25μL体系为例)。
  

  成分	用量
  10×Reaction Buffer	2.5μL
  超纯水	(16.5-x) μL
  底物IgG	＜10μg
  IdeZ Protease(10U/μL)	1μL
  总体积	25μL

  • 建议最后添加IdeZ Protease。
    
  • 酶切不同物种的IgG，建议适当摸索最佳孵育时间和酶浓度。对于小鼠IgG2a和IgG3的酶切，建议增加酶量(建议5倍至10倍作为起点)或延长反应孵育时间(2小时至过夜)以实现充分酶切。
    
  • 如需减少酶量，建议使用本制品提供的IdeZ稀释缓冲液对IdeZ Protease进行稀释，稀释过程中请勿使用Vortex剧烈振荡，以免蛋白变性而失活。
    
  • 在使用pH6～8范围以外的缓冲液(例如醋酸盐缓冲液)时，孵育时间和酶量需要根据实际情况进行优化。
• 用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，随后低速离心以使粘附在管壁上的液体聚集于管底。
  
• 反应条件：37℃孵育30～60分钟。
  
• 终止反应：65℃孵育10分钟。
  
• 将反应后的产物进行变性或非变性PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝染色后拍照观察并分析酶切效果。
  
• 其它用途请自行参考IdeZ Protease的相关文献资料进行。

• 与IdeS Protease相比，IdeZ Protease的优势是什么？
  IdeZ Protease与IdeS Protease具有相同的特异性，两者都是在IgG铰链区域下方完全相同的单个位点进行切割。但IdeZ Protease的酶切效率高于IdeS Protease，能够更有效地切割小鼠IgG2a。因此，IdeZ Protease比IdeS Protease更通用。
  
• IdeZ Protease在PBS中具有活性吗？
  是的，IdeZ Protease在PBS中具有活性。IdeZ Protease能够在pH范围为6-9的缓冲体系中发挥酶切活性，但是在pH5.5以下，其活性显著降低。推荐使用本制品提供的10×Reaction Buffer进行酶切反应。
  
• IgG经IdeZ Protease酶切后，能否使用Protein A磁珠或Protein A Agarose纯化富集Fab和Fc片段？
  可以。在用IdeZ Protease切割后，可使用protein A磁珠或Protein A Agarose富集Fc和Fab片段。Fc片段会与磁珠或Agarose结合，Fab片段仍保留在上清中。注明仅和Fc片段结合的Protein G磁珠或Protein G Agarose，也可用于分离Fc和Fab片段。
  
• IdeZ Protease能否切割除人以外其他物种的IgGs？
  IdeZ Protease可有效切割人、人源化、嵌合、绵羊、兔、大鼠和猴IgG；延长孵育时间也可切割小鼠IgG2a和IgG3；还可以切割许多Fc融合蛋白以及抗体药物偶联物(ADC)。但IdeZ Protease不可用于切割山羊、牛、猪IgG，以及小鼠IgG1或IgG2b。
  
• IdeZ Protease能否切割除IgG以外的其它类型Ig？
  不能，IdeZ Protease仅能有效切割IgG，对于IgA、IgD、IgE或IgM没有切割活性。
  
• IdeZ Protease对IgG的特异性切割位点是什么?
  IdeZ Protease对人和小鼠的特异性识别与切割位点如下表所示：
  

  Subclass	Hinge/CH2 sequence	IdeZ Activity
  Human IgG1	CPPCPAPELLG^GPSVF	+ + +
  Human IgG2	CPPCPAPP_VA^GPSVF	+ + +
  Human IgG3	CPRCPAPELLG^GPSVF	+ + +
  Human IgG4	AHHAQAPEFLG^GPSVF	+ + +
  Mouse IgG1	PCICTVPEV_SSVF	-
  Mouse IgG2a	CPPCAAPNLLG^GPSVF	+ + +
  Mouse IgG2b	CHKCPAPNLEGGPSVF	-
  Mouse IgG3	GSSCPAGNILG^GPSVF	+ + +

• 在同一反应体系中，PNGase F能否和IdeZ Protease一起使用，以便对抗体的Fc部分进行去糖基化？
  可以。PNGase F可以与IdeZ Protease在同一个步骤中一起使用，实现对IgG的酶切片段化，同时去除Fc的聚糖。推荐使用去糖基化酶对抗体进行去糖基化处理。

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